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本试剂盒可以抽提动物组织、鼠尾、培养细胞、细菌、酵母、动物血液、昆虫以及固定组织的包括基因组DNA在内的总DNA。一个试剂盒通过说明书中提供的不同操作方法，可以抽提除植物样品外的几乎所有样品中的总DNA。

样品首先被蛋白酶K消化，随后加入适合DNA结合到纯化柱上的缓冲液，然后加入到纯化柱内。通过高速离心，使DNA在穿过纯化柱的瞬间，结合到纯化柱上，随后通过两次洗涤去除各种杂质，最后通过洗脱液把DNA洗脱下来。整个过程无需酚氯仿抽提，无需酒精沉淀，样品裂解后仅需约15分钟即可完成。

通过本试剂盒纯化得到的基因组DNA的长度最长可达50kb左右，平均为30kb左右，最短为100bp的DNA也可以被纯化。如需获得更长的基因组DNA，对于哺乳动物样品，包括组织或细胞等，可以使用我司的哺乳动物基因组DNA抽提试剂盒(货号：YT012)。

本试剂盒可以抽提少至数百个细胞，多至25mg组织、0.5-1cm鼠尾、500万个培养细胞、20亿个细菌或5000万个酵母。样品用量过多，反而会影响抽提效果。如果待抽提样品的DNA含量小于5ng，建议加入适当量的carrier DNA，例如poly-dT或其它对后续实验没有干扰的DNA，也可以加入适当量的carrier RNA，例如yeast RNA等，以改善抽提效果。

本试剂盒的标准操作步骤抽提得到的总DNA会含有少量RNA，但如果按照可选步骤加入RNase A，就可以获得不含RNA的高纯度总DNA。含有RNA的总DNA可以用于PCR，但对于某些其它的后续反应可能会产生一些影响。通过本试剂盒获得的总DNA，OD260/OD280的范围通常在1.7至1.9之间。

纯化柱对于DNA的最大容量约为30μg。通常每200万Hela细胞或500万淋巴细胞可以抽提得到15～25μg总DNA，每25mg肝、脑、肾组织可以抽提得到10～30μg总DNA，每25mg心、肺组织可以抽提得到5～10μg总DNA，每10mg脾组织可以抽提得到5～30μg总DNA，每1.2cm小鼠尾尖或0.3cm大鼠尾尖可以获得10～25μg总DNA。

• 抽提细菌、酵母样品时还需要一些特定的试剂，详情请参考相关实验步骤。
  
• 如需制备不含RNA的高纯度总DNA，需自备RNase A。
  
• 温度较低时样品裂解液A或样品裂解液B中可能会有沉淀产生，属正常现象。使用前必须检查一遍。如有沉淀，55℃水浴孵育使沉淀溶解，混匀后使用。
  
• 第一次使用前洗涤液I需添加7mL无水乙醇，洗涤液II需添加24mL无水乙醇，混匀，并在瓶上做好标记。
  
• 本试剂盒需使用55℃水浴，请提前作好准备。
  
• 除特别说明外，每次Vortex应控制在5～10秒左右。
  
• 本试剂盒所有操作均在室温进行，操作时无需冰浴。所有离心也均在室温进行。
  
• 废液收集管在一次抽提中需多次使用，切勿中途丢弃。
  
• 参考如下使用说明，从某些样品中抽提总DNA不需要使用样品裂解液A。

• 从动物组织中提取总DNA
  
  • 取不超过25mg的组织(脾不超过10mg)，剪切成尽可能小的碎片，加入180μL样品裂解液A。
    请勿使用过多的样品，过多的样品会导致抽提效果下降。较小的组织碎片会使裂解速度加快，裂解效果提高。新鲜或冻存的组织均可，但固定过的组织请参考后续的其它步骤进行。
    
  • 加入20μL蛋白酶K，Vortex混匀，55℃水浴孵育至完全裂解。
    在孵育期间可以偶尔取出样品Vortex以加快裂解速度。裂解的时间因组织不同而有所不同，通常可在1～3小时内完成。为方便起见，可以直接裂解过夜，裂解过夜对抽提效果无任何负面影响。组织完全裂解后可以呈粘稠状，但不应该呈可把DNA纯化柱堵住的凝胶状。如果消化过夜仍呈凝胶状，说明样品用量过多，作为补救措施，可以把整个反应体系放大一倍。
    
  • 清除RNA(可选做)。如果希望获得不含RNA的高纯度总DNA，加入4μL 100mg/ml RNase A，Vortex混匀。室温(15～25℃)放置2分钟。
    转录活性水平很高的组织例如肝和肾组织，RNA含量很高，在不做清除RNA的操作步骤(步骤1.c)的情况下，会导致最后获得的总DNA含有小部分RNA。如果残余的少量RNA对后续实验没有干扰，可以不进行本步实验操作，直接进入步骤d。
    
  • 最高速剧烈Vortex 15秒。加入200μL样品裂解液B，Vortex混匀。70℃孵育10分钟。
    加入样品裂解液B后需立即Vortex混匀。加入样品裂解液B后可能会产生白色沉淀，但大多数情况在70℃孵育后会溶解。即使70℃孵育后仍有白色沉淀也不会干扰后续实验。有些组织例如肺、脾，在加入样品裂解液B后可能会形成凝胶状物，此时需剧烈晃动或Vortex样品，以尽量破坏凝
    胶状物。
    
  • 加入200μL无水乙醇，Vortex混匀。
    加入乙醇后必须充分混匀，否则会严重影响抽提效果。加入乙醇后可能产生白色沉淀，属正常现象，后续步骤中必须把白色沉淀和溶液全部转移到纯化柱内。
    
  • 把步骤e中的混合物加入到DNA纯化柱内。≥6000g(约≥8000rpm)离心1分钟。倒弃废液收集管内液体。
    进行本步骤前需将纯化柱置于废液收集管上。倒弃废液后回收废液收集管。
    注意：必须把沉淀全部转移到DNA纯化柱内，否则会严重影响抽提效果！
    
  • 加入500μL洗涤液I，≥6000g(约≥8000rpm)离心1分钟。倒弃废液收集管内液体。
    进行本步骤前需将纯化柱置于废液收集管上。倒弃废液后回收废液收集管。
    
  • 加入600μL洗涤液II，≥18000g(约≥12000rpm)离心1分钟。倒弃废液收集管内液体。
    进行本步骤前需将纯化柱置于废液收集管上。倒弃废液后回收废液收集管。
    
  • 再≥18000g(约≥12000rpm)离心1分钟，以去除残留的乙醇。
    不可把步骤h的离心时间延长而省略本步骤。倒弃废液后再离心可以确保充分去除残留的乙醇。
    
  • 将DNA纯化柱置于一洁净的1.5mL离心管上，加入50～200μL洗脱液。室温放置1～3分钟。≥12000rpm离心1分钟。所得液体即为纯化得到的总DNA。
    洗脱液需要直接加至纯化柱管内柱面中央，使液体被纯化柱吸收。如果有必要，可以使用去离子水或TE进行洗脱。使用较小体积的洗脱液可以使获得的总DNA的浓度较高，但洗脱下来的DNA量相对较少。如果对于获得较多量的DNA非常重要，可以在第一次用200μL洗脱液洗脱后，再用200μL洗脱液重复洗脱一次。第二次洗脱可以增加产量10～80%，特别是当第一次洗脱下来的DNA大于10μg时，第二次洗脱可以获得第一次洗脱时50～80%的量。一次性加入多于200μL的洗脱液对洗脱效果的改善相对不太明显。
• 从鼠尾中抽提总DNA
  
  • 取0.4-0.6cm的大鼠尾尖一段，或小鼠尾尖最多两段，加入180μL样品裂解液A。
    小鼠尾尖最长不能超过1.2cm，大鼠尾尖不能超过0.6cm。如果使用的是成年大鼠或小鼠，建议仅使用0.4-0.6cm长的尾尖。如果抽提鼠尾的DNA用genotyping，使用0.2-0.3cm长的尾尖已经足够。
    
  • 加入20μL蛋白酶K，Vortex混匀，55℃水浴孵育至完全裂解。
    在孵育期间可以偶尔取出样品Vortex以加快裂解速度。并确保鼠尾浸没在裂解液内。裂解完全通常需6～8小时。为方便起见，可以直接裂解过夜，裂解过夜对抽提效果无任何负面影响。组织完全裂解后可以呈粘稠状，但不应该呈可把DNA纯化柱堵住的凝胶状。如果消化过夜仍呈凝胶状，说明样品用量过多，作为补救措施，可以把整个反应体系放大一倍。
    
  • 清除RNA(可选做)。如果希望获得不含RNA的高纯度总DNA，加入4μL 100mg/ml RNase A，Vortex混匀。室温(15～25℃)放置2分钟。
    鼠尾中RNA含量很低，但在不做清除RNA的操作步骤(步骤2.c)的情况下，会导致最后获得的总DNA含有少量的RNA。如果残余的少量RNA对后续实验没有干扰，可以不进行本步实验操作，直接进入步骤d。
    
  • 按照等体积混合适当体积的样品裂解液B和无水乙醇，Vortex混匀。
    每一个样品，需混合200μL样品裂解液B和200μL无水乙醇。如果有10个样品，则需混合2mL样品裂解液B和2mL无水乙醇，以此类推。配制好的样品裂解液B和无水乙醇的等体积混合液，室温放置，3个月内有效。必须Vortex充分混匀，否则会严重影响抽提效果。
    
  • 最高速剧烈Vortex 15秒。加入400μL步骤d配制的样品裂解液B和无水乙醇等体积混合液，剧烈Vortex混匀。
    加入样品裂解液B和无水乙醇的等体积混合液后可能会产生白色沉淀，属正常现象，后续步骤中必须把白色沉淀和溶液全部转移到纯化柱内，沉淀不会影响抽提效果。
    
  • 把步骤e中的混合物加入到DNA纯化柱内。≥6000g(约≥8000rpm)离心1分钟。倒弃废液收集管内液体。
    进行本步骤前需将纯化柱置于废液收集管上。倒弃废液后回收废液收集管。
    注意：必须把沉淀全部转移到DNA纯化柱内，否则会严重影响抽提效果！
    
  • 加入500μL洗涤液I，≥6000g(约≥8000rpm)离心1分钟。倒弃废液收集管内液体。
    进行本步骤前需将纯化柱置于废液收集管上。倒弃废液后回收废液收集管。
    
  • 加入600μL洗涤液II，≥18000g(约≥12000rpm)离心1分钟。倒弃废液收集管内液体。
    进行本步骤前需将纯化柱置于废液收集管上。倒弃废液后回收废液收集管。
    
  • 再≥18000g(约≥12000rpm)离心1分钟，以去除残留的乙醇。
    不可把步骤h的离心时间延长而省略本步骤。倒弃废液后再离心可以确保充分去除残留的乙醇。
    
  • 将DNA纯化柱置于一洁净的1.5mL离心管上，加入50～200μL洗脱液。室温放置1～3分钟。≥12000rpm离心1分钟。所得液体即为纯化得到的总DNA。
    洗脱液需要直接加至纯化柱管内柱面中央，使液体被纯化柱吸收。如果有必要，可以使用去离子水或TE进行洗脱。使用较小体积的洗脱液可以使获得的总DNA的浓度较高，但洗脱下来的DNA量相对较少。如果对于获得较多量的DNA非常重要，可以在第一次用200μL洗脱液洗脱后，再用200μL洗脱液重复洗脱一次。第二次洗脱可以增加产量10～80%，特别是当第一次洗脱下来的DNA大于10μg时，第二次洗脱可以获得第一次洗脱时50～80%的量。一次性加入多于200μL的洗脱液对洗脱效果的改善相对不太明显。
• 从培养的动物细胞中抽提总DNA
  
  • 收集最多不超过500万的细胞，离心沉淀后重悬于200μL PBS中。
    PBS需自备。如果使用冻存的细胞沉淀，先把细胞沉淀解冻，并轻轻弹散，然后再加入PBS。对于基因组DNA含量较高的细胞，例如Hela细胞，应使用较少的细胞，例如100-200万Hela细胞。
    
  • 清除RNA(可选做)。如果希望获得不含RNA的高纯度总DNA，加入4μL 100mg/ml RNase A，Vortex混匀。室温(15～25℃)放置2分钟。
    在不做清除RNA的操作步骤(步骤3.b)的情况下，会导致最后获得的总DNA含有小部分RNA。如果残余的少量RNA对后续实验没有干扰，可以不进行本步实验操作，直接进入步骤c。
    
  • 加入20μL蛋白酶K，Vortex混匀。
    
  • 加入200μL样品裂解液B，Vortex混匀。70℃孵育10分钟。
    加入样品裂解液B后必须立即Vortex混匀。不可把蛋白酶K直接和样品裂解液B混合。
    
  • 加入200μL无水乙醇，Vortex混匀。
    加入乙醇后必须充分混匀，否则会严重影响抽提效果。加入乙醇后可能会产生白色沉淀，属正常现象，后续步骤中必须把白色沉淀和溶液全部转移到纯化柱内。
    
  • 把步骤e中的混合物加入到DNA纯化柱内。≥6000g(约≥8000rpm)离心1分钟。倒弃废液收集管内液体。
    进行本步骤前需将纯化柱置于废液收集管上。倒弃废液后回收废液收集管。
    注意：必须把沉淀全部转移到DNA纯化柱内，否则会严重影响抽提效果！
    
  • 加入500μL洗涤液I，≥6000g(约≥8000rpm)离心1分钟。倒弃废液收集管内液体。
    进行本步骤前需将纯化柱置于废液收集管上。倒弃废液后回收废液收集管。
    
  • 加入600μL洗涤液II，≥18000g(约≥12000rpm)离心1分钟。倒弃废液收集管内液体。
    进行本步骤前需将纯化柱置于废液收集管上。倒弃废液后回收废液收集管。
    
  • 再≥18000g(约≥12000rpm)离心1分钟，以去除残留的乙醇。
    不可把步骤h的离心时间延长而省略本步骤。倒弃废液后再离心可以确保充分去除残留的乙醇。
    
  • 将DNA纯化柱置于一洁净的1.5mL离心管上，加入50～200μL洗脱液。室温放置1～3分钟。≥12000rpm离心1分钟。所得液体即为纯化得到的总DNA。
    洗脱液需要直接加至纯化柱管内柱面中央，使液体被纯化柱吸收。如果有必要，可以使用去离子水或TE进行洗脱。使用较小体积的洗脱液可以使获得的总DNA的浓度较高，但洗脱下来的DNA量相对较少。如果对于获得较多量的DNA非常重要，可以在第一次用200μL洗脱液洗脱后，再用200μL洗脱液重复洗脱一次。第二次洗脱可以增加产量10～80%，特别是当第一次洗脱下来的DNA大于10μg时，第二次洗脱可以获得第一次洗脱时50～80%的量。一次性加入多于200μL的洗脱液对洗脱效果的改善相对不太明显。
• 从动物血液中抽提总DNA
  本操作方法也适用于血沉棕黄层(buffy coat)和骨髓(bone marrow)的总DNA抽提。
  
  • 取50～100μL红细胞无细胞核的血，或5～10μL活细胞有细胞核的血。
    人、猴、牛、兔、大鼠、小鼠等的红细胞无细胞核，鸟、鱼、蛙等的红细胞有细胞核。红细胞有细胞核会导致相同体积的血液内DNA的含量非常高。
    
  • 加入20μL蛋白酶K。
    
  • 加入PBS至总体积为220μL，Vortex混匀。
    
  • 加入200μL样品裂解液B，Vortex混匀。70℃孵育10分钟。
    
  • 转步骤3.e。后续步骤同“从培养的动物细胞中抽提总DNA”3.e起的步骤。
• 从石蜡包埋的组织样品中抽提总DNA
  由于包埋的组织通常已经被固定，通常仅能获得长度小于650bp的DNA。乙醇或甲醛固定的石蜡包埋组织样品相对比较适合DNA的抽提，而有交联作用的固定试剂(例如锇酸)固定的组织则不适合用于抽提DNA。需自备二甲苯。
  
  • 取一块小于25mg的包埋块，加入1.2mL二甲苯，剧烈Vortex，以充分脱腊。
    
  • 台式离心机最高速(12000～14000rpm)室温离心5分钟，弃上清。
    注意，去除上清的时候要非常小心，不要把沉淀丢失了。
    
  • 加入1.2mL无水乙醇，轻轻Vortex混匀，以去除残留的二甲苯。
    
  • 台式离心机最高速(12000～14000rpm)室温离心5分钟，弃上清。
    注意，去除上清的时候要非常小心，不要把沉淀丢失了。
    
  • 重复步骤c和d一次，即再用乙醇洗涤样品一次。
    
  • 弃上清后再最高速离心1分钟，用20μL枪小心吸除残留的液体。
    
  • 室温放置数分钟至乙醇全部挥发。
    
  • 加入180μL样品裂解液A。
    
  • 转步骤1.b，后续步骤同“从动物组织中提取总DNA”1.b起的步骤。
• 从甲醛固定的组织中抽提总DNA
  由于组织已经被固定，通常仅能获得长度小于650bp的DNA。甲醛或乙醇固定的组织样品相对比较适合DNA的抽提，而有交联作用的固定试剂(例如锇酸)固定的组织则不适合用于抽提DNA。乙醇固定的组织可以参考甲醛固定的组织的抽提方法进行总DNA的抽提。
  
  • 取不超过25mg的组织，用PBS洗涤两次，以充分去除固定液。
    
  • 去除PBS，转步骤1.a，后续步骤同“从动物组织中提取总DNA”1.a起的步骤。
• 从革兰氏阴性菌中抽提总DNA
  
  • 离心收集最多不超过20亿个细菌，弃上清。
    
  • 加入180μL样品裂解液A，充分重悬细菌。
    
  • 转步骤1.b，后续步骤同“从动物组织中提取总DNA”1.b起的步骤。
• 从革兰氏阳性菌中抽提总DNA
  需自备溶菌酶，并配制溶菌酶溶液：20mM Tris，pH8.0，2mM EDTA，1.2% Triton X-100，20mg/ml溶菌酶。溶菌酶在临使用前加入。
  
  • 离心收集最多不超过20亿个细菌，弃上清。
    
  • 用180μL溶菌酶溶液充分重悬细菌。
    
  • 37℃孵育30分钟以裂解细菌。
    
  • 加入20μL蛋白酶K，Vortex混匀。
    
  • 加入200μL样品裂解液B，Vortex混匀。
    不可把蛋白酶K直接加入到样品裂解液B中。
    
  • 70℃孵育30分钟。
    
  • 转步骤1.e，后续步骤同“从动物组织中提取总DNA”1.e起的步骤。
• 从酵母中抽提总DNA
  需自备用于裂解酵母的酶lyticase，并配制酵母裂解液：1M山梨糖醇(sorbitol)，100mM EDTA，14mM 2-巯基乙醇。
  
  • 离心收集最多不超过50万个酵母，弃上清。
    
  • 用600μL上述酵母裂解液重悬，加入200U lyticase，30℃孵育30分钟。
    注意：裂解的时间会随酵母的种类不同而有所不同，详细情况请参考lyticase的说明书。
    
  • 300g离心10分钟收集沉淀，弃上清。
    
  • 沉淀用180μL样品裂解液A重悬。
    
  • 转步骤1.b，后续步骤同“从动物组织中提取总DNA”1.b起的步骤。
• 从昆虫中抽提总DNA
  
  • 用液氮冷冻后研碎处理：
    ① 取最多不超过50mg昆虫(例如果蝇)，液氮冷冻后研碎，转移至1.5mL离心管中。
    ② 加入180μL样品裂解液A。
    ③ 转步骤1.b，后续步骤同“从动物组织中提取总DNA”1.b起的步骤。
    
  • 用匀浆器匀浆处理：
    ① 取最多不超过50mg昆虫(例如果蝇)。
    ② 加入180μL PBS，用电动匀浆器或玻璃匀浆器匀浆。
    ③ 转步骤3.b，后续步骤同“从培养的动物细胞中抽提总DNA”3.b起的步骤。
• 从其它样品中抽提总DNA
  对于某些样品需使用特定的裂解液裂解，可以参考如下方法进行总DNA的抽提。
  
  • 样品用200μL特定的裂解液裂解。裂解需确保呈溶液状态，如果有不溶物需通过离心沉淀去除。
    
  • 加入20μL蛋白酶K。
    
  • 加入200μL样品裂解液B，立即Vortex混匀。
    
  • 70℃孵育10分钟。
    检查整个溶液的pH值，确保pH值小于7.0，否则DNA结合到纯化柱的效率会很低。
    
  • 转步骤1.e，后续步骤同“从动物组织中提取总DNA”1.e起的步骤。